介紹
核磁共振 (NMR) 是一種極其強(qiáng)大的表征技術(shù)，常用于藥物研究以鑒定新化合物、評估純度以及表征和優(yōu)化化學(xué)反應(yīng)，無論是在線（使用流通池）、離線還是在線（用于核磁共振管反應(yīng)或等分分析）。雖然不太常見，但它也已被確立為制藥行業(yè)常規(guī)定量分析的有用技術(shù)。1,2,3,4 臺(tái)式 NMR 已成為一種易于使用的技術(shù)，可將 NMR 光譜的使用擴(kuò)展到初創(chuàng)企業(yè)和中小企業(yè)制藥公司，并提供易于使用、緊湊且可自動(dòng)化的替代方案，允許 qNMR 直接納入質(zhì)量控制實(shí)驗(yàn)室并供技術(shù)人員使用。
在這方面，我們描述了使用臺(tái)式 NMR 對活性藥物成分進(jìn)行結(jié)構(gòu)確認(rèn)；降解產(chǎn)物和/或雜質(zhì)的評估，以評估該技術(shù)在測定和含量均勻性測試中的功效和性能。
NMR 與常用方法相比具有許多優(yōu)勢，例如滴定、紅外 (IR) 光譜、拉曼光譜和色譜法。它具有化學(xué)特異性、非靶向性、非破壞性、無需校準(zhǔn)的固有定性，并且需要非常簡單的樣品制備。它不需要準(zhǔn)備稀釋系列，不消耗大量溶劑，也不需要真正的標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)5進(jìn)行分析。
在本應(yīng)用說明中，我們使用 1H NMR 評估作為參考標(biāo)準(zhǔn)購買的他達(dá)拉非的純度（圖 1a），并使用兩種市售的含有Tadalafil的成分進(jìn)行分析測試。這些藥物以商品名 Cialis 和通用名 Apo-Tadalafil 出售。這些藥物用于治療良性前列腺增生6、勃起功能障礙7和肺動(dòng)脈高壓8。
在此定量 NMR 分析中，對苯二甲酸二甲酯（圖 1b）用作內(nèi)部校準(zhǔn)物。選擇它是因?yàn)樗?1H 共振中至少有一個(gè)與目標(biāo)化合物的共振不重疊，并且它的 T1 值比其他可能的 qNMR 內(nèi)標(biāo)短。此處提供的示例特定于制藥，但 qNMR 方法是通用的，可以在純度測定對流程至關(guān)重要的任何領(lǐng)域的常規(guī)分析中進(jìn)行驗(yàn)證。
圖 1：a) Tadalafil的結(jié)構(gòu)，b) 對苯二甲酸二甲酯 (DMT) 的結(jié)構(gòu)。 綠色和紅色圓圈代表本研究中評估的質(zhì)子。
實(shí)驗(yàn)程序：Tadalafil參比標(biāo)準(zhǔn)品純度測定
將參考標(biāo)準(zhǔn)化合物（Tadalafil，11.78 mg）Lot#：LRAB8867 和經(jīng)認(rèn)證的內(nèi)部校準(zhǔn)物（對苯二甲酸二甲酯 (DMT)，2.73 mg）Lot#：BCBT9974 準(zhǔn)確稱量到小瓶中，并加入 600 μL DMSO-d6.使用渦旋混合器混合溶液直至樣品和內(nèi)標(biāo)完全溶解。將得到的澄清溶液轉(zhuǎn)移到 5 mm NMR 管中，并在確定 T1 值后獲得 1H NMR 譜。8.08 ppm DMT 信號的 T1 值為 2.82 s，Tadalafil 5 .92 ppm 信號的 T1 值為 0.53 s。所有化合物均購自 Sigma-Aldrich，無需進(jìn)一步純化即可使用。
光譜是在 32 °C 下使用 Nanalysis 60PRO 臺(tái)式 NMR 光譜儀在 60 MHz 質(zhì)子頻率（1.418 特斯拉）下獲得的。使用以下采集參數(shù)進(jìn)行實(shí)驗(yàn)：復(fù)數(shù)點(diǎn)數(shù)，8192；光譜寬度，24 ?ppm；掃描次數(shù)，32；掃描延遲，20 s；光譜中心，8.03 ppm；采集時(shí)間，5.57 秒； 90° 脈沖持續(xù)時(shí)間，15.1 μs。每個(gè)光譜都應(yīng)用零填充處理，零填充點(diǎn)數(shù)等于65536，進(jìn)行相位和基線校正，洛倫茲到高斯窗口乘法應(yīng)用于FID（指數(shù)線加寬 (lb) 和高斯線加寬 (gb)分別設(shè)置為 -0.1 和 0.3 Hz）。9 光譜采集一式五份進(jìn)行。
結(jié)果與討論：Tadalafil 參考標(biāo)準(zhǔn)化合物純度測定
使用以下等式 (1) 計(jì)算分析物 Px 的純度：
式中 Ax 為Tadalafil在 5.92 ppm 處的信號積分值； ADMT是屬于DMT的8.08ppm處信號的積分值； NDMT 和 Nx 分別對應(yīng)于 DMT 和Tadalafil的自旋數(shù)； Mx 和 DMT 分別是Tadalafil和 DMT 的分子量； mx 是Tadalafil的加權(quán)質(zhì)量； mDMT 和 PDMT 分別是 DMT10 的加權(quán)質(zhì)量和報(bào)告的純度。
表 1：使用對苯二甲酸二甲酯 (DMT) 作為內(nèi)部校準(zhǔn)物測定Tadalafil (X) 參考化合物的純度。
#商業(yè)供應(yīng)商報(bào)告的價(jià)值10
應(yīng)用于圖2中每個(gè)信號的預(yù)設(shè)積分區(qū)域?yàn)椋篋MT 為 8.2791 至 7.9320 ppm，化合物 X 為 6.0283 至 5.7700 ppm。用表 1 中報(bào)告的值替換方程 1 的變量值，Px 純度值為 達(dá)到 99.7 ± 0.4。 計(jì)算值與供應(yīng)商公司報(bào)告的值范圍一致11 (99.7 ± 0.1)。
圖 2. Tadalafil和 DMT 在 DMSO-d6 中的混合物的 1H NMR 譜，使用Nanalysis 臺(tái)式 60PRO 采集。 綠色和紅色圓圈分別代表Tadalafil和 DMT 評估下的質(zhì)子。
實(shí)驗(yàn)程序：Cialis 和 Apo- Tadalafil 試驗(yàn)
通過稱重和粉碎每種藥物的五片來進(jìn)行測定測試。 藥盒上標(biāo)明每片含有 20 毫克Tadalafil。 每個(gè)充分混合的粉末（西力士 210.91 毫克和 Apo-Tadalafil 239.07 毫克）和校準(zhǔn)物化合物 DMT（西力士 2.25 毫克和 Apo-Tadalafil 3.6 毫克）的一部分，代表大約 20 毫克活性化合物 , 在分析天平 (Mettler-Toledo MS105DU) 上稱重，然后加入DMSO-d6 (950 μL)。 將裝有混合物的兩個(gè)小瓶渦旋 5 分鐘，然后再超聲 20 分鐘。 離心后，將上清液過濾并加入 5 mm 標(biāo)準(zhǔn) NMR 管中。每個(gè) 1H NMR 光譜中使用的采集和處理參數(shù)與純度測定程序中所述的相同。
結(jié)果和討論：Cialis 和 Apo- Tadalafil 試驗(yàn)
為了確定每片中Tadalafil的平均質(zhì)量，使用公式 2：
其中 mpowder 是用于化驗(yàn)測試的片劑粉末樣品的加權(quán)質(zhì)量，T 是平均片劑重量。 任何其他參數(shù)的含義與公式 1 中所述相同
表 2：使用對苯二甲酸二甲酯 (DMT) 作為校準(zhǔn)化合物測定希愛力片劑中他達(dá)拉非的平均質(zhì)量。
#Value reported by the commercial supplier10
表 3：使用對苯二甲酸二甲酯 (DMT) 作為校準(zhǔn)化合物測定 Apo-Tadalafil片中Tadalafil的平均質(zhì)量。
#商業(yè)供應(yīng)商報(bào)告的價(jià)值10
通過對 DMT 信號應(yīng)用 8.1964 到 7.9930 ppm 和Tadalafil信號從5.9943 到 5.8340 ppm 的預(yù)設(shè)積分區(qū)域來確定所選信號的相對面積（圖 2）。 將表 2 和 3 中報(bào)告的值替換為公式 2 中的相應(yīng)變量，獲得了西力士每片 19.8 ± 0.3 毫克和每片 Apo-Tadalafil片20.3 ± 0.2 毫克的平均質(zhì)量。 這兩個(gè)值都在 USP 專論接受的他達(dá)拉非的范圍內(nèi)，報(bào)告為 20 ± 2 mg，以及高場數(shù)據(jù)，Cialis 和Apo-Tadalafil分別確定為 20.0 mg 和 20.9 mg。
圖 3. Tadalafil參考標(biāo)準(zhǔn)在 DMSO-d6 中的 1H NMR 譜（黑色）； 用 DMT 在 DMSO-d6 中提取 Cialis 片劑的 1H NMR 譜圖（藍(lán)色）； 用 DMT 在DMSO-d6 中提取 Apo-Tadalafil片劑的 1H NMR 譜（紅色）。 所有光譜均在 Nanalysis 60PRO 中采集。
除了在化驗(yàn)測試中獲得的定量信息外，在使用NMR分析時(shí)，還可以觀察到賦形劑的指紋并用于質(zhì)量控制（圖 3）。對于所研究的案例，供應(yīng)商報(bào)告了以下賦形劑：交聯(lián)羧甲基纖維素鈉、羥丙基纖維素、羥丙基甲基纖維素、氧化鐵、一水乳糖、硬脂酸鎂、微晶纖維素、月桂基硫酸鈉、滑石、二氧化鈦和用于 Cialis 的三乙酸甘油酯和交聯(lián)羧甲基纖維素鈉、羥丙基纖維素 、乳糖一水合物、硬脂酸鎂、微晶纖維素、十二烷基硫酸鈉、二氧化鈦、氧化鐵紅、氧化鐵黃、羥丙甲纖維素、泊洛沙姆和用于 Apo-Tadalafil的聚乙二醇。
結(jié)論
臺(tái)式核磁共振成功地用于評估Tadalafil的純度，并對兩種含有他達(dá)拉非作為活性成分的不同片劑進(jìn)行分析測試。與其他方法一樣，在數(shù)據(jù)采集和評估之前需要一個(gè)樣品制備步驟。但是，使用 NMR，可以在幾分鐘內(nèi)獲取數(shù)據(jù)。此外，數(shù)據(jù)評估很簡單，因?yàn)?NMR 中的峰面積與分子中存在的質(zhì)子數(shù)成正比。具有已知濃度和結(jié)構(gòu)的內(nèi)部校準(zhǔn)物具有在可用于目標(biāo)分析物定量的區(qū)域中提供一種或多種信號的作用。
這項(xiàng)研究表明，臺(tái)式 NMR 在質(zhì)量控制分析中的作用有多大，以及它如何在藥物評估的許多步驟中用作補(bǔ)充方法。一旦該方法被開發(fā)和驗(yàn)證，就可以快速獲得結(jié)果，廢溶劑量少，不需要專家運(yùn)行樣品或評估數(shù)據(jù)，更不用說獲得的大量信息。
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